Centrul Medical Aide Sante - Medicina Muncii - Test Intoleranta

Determinarea fibrinogenului plasmatic - Fibrinogenul este o proteina de faza acuta sintetizata de ficat care se gaseste sub forma solubila (forma circulanta) in plasma si in alfa granulele plachetare. Fibrinogenul are rol important in coagulare – factorul I al coagularii. Sub actiunea trombinei (enzima cheie a cascadei coagularii) prin polimerizarea fibrinogenului se formeaza fibrina ce intra in alcatuirea cheagului de fibrina – dopul de fibrina ce opreste sangerarea. Formarea dopului de fibrina este rezultatul activitatii procoagulante a unei cascade de reactii ce definesc clasica “cascada coagularii”. Plasmina (enzima cheie a sistemului enzimatic al fibrinolizei) actioneaza atat asupra fibrinogenului cat si asupra fibrinei si produce liza enzimatica a cheagului de fibrina cu reluarea fluxului sanguin in segmentul afectat. Vezi aici prezentarea schematica succinta a cascadei coagularii si cascadei fibrinolizei.

            Valori normale : 200 – 400 mg/dL.

·          Scaderea fibrinogenului apare in afectiuni hepatice cronice. Scaderi ale fibrinogenului se mai intalnesc in coagularea intravasculara diseminata (consum excesiv), afibrigenemii / hipofibrinogemii, dupa terapia anticoagulanta din infactul miocardic (tromboliza enzimatica).  La valori ale fibrinogenului de sub 50 mg/dL (valoare minima de alerta) exista riscul de a dezvolta sindroame hemoragice spontane sau dupa interventii chirurgicale.

·          Fibrinogenul creste foarte mult in bolile infectioase acute, afectiuni inflamatorii, pneumonii, unele afetiuni cardio-vasculare (infarct niocardic, insuficienta cardiaca decompensata), reumatism poliarticular acut, tumori maligne sau dupa tratamentul cu radiatii ionizante.  Valorile crescute ale fibrinogenului pot asocia un risc crescut pentru tromboza cerebrala (AVC accident vascular cerebral) sau tromboza cardiaca (infarct miocardic) incidente ce se pot produce la valori ale fibrinogenului plasmatic superioare de 700 mg/dL (valoare maxima de alerta ce trebuie corelata cu prezenta/absenta fenomenului inflamator). La gravide fibrinogenul este crescut in mod fiziologic.

Pentru personalul medical – conditii de recoltare determinare fibrinogen plasmatic

·          Recoltare – vacutainer albastru (citrat) – cu respectarea raportului : 1 parte anticoagulant – 9 parti sange venos. Recoltarea se face prin punctie venoasa si deoarece presiunea venoasa in momentul recoltarii trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si diastolice, eprubeta cu citrat este ultima care se recolteaza dupa desfacearea garoului. Dupa recoltare se omogenizeaza continutului vacutainerului prin inversiuni repetate ale tubului de recolta. Daca punctia venoasa esueaza, o  noua tentativa pe aceeasi vena se face de abia dupa 10 minute.

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate a probei recoltate. Probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba. Pentru diagnostic tintit este recomandabil specificarea conditiei clinice a pacientului.

·          Tehnica de lucru: determinare directa coagulometrica a fibronogenului (metoda Clauss care masoara activitatea coagulanta a fibrinogenului – peste plasma umana diluata 1:10 se adauga un exces de trombina si se masoara timpul de formare a cheagului) determinare indirecta (nefelometrica / turbidimetrica) folosind o reactie tip PT modificat – opaciatea cheagului obtinut este direct proportional cu cantitatea de fibrinogen din proba).

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 1 zile

Determinarea TIMPULUI QUICK / INR / AP (activitate de protrombina) - Timpul de protrombina - este o analiza screening utila in evaluarea functiei de coagulare a sangelui: testul exploreaza calea extrinseca si calea comuna / complexul protrombinazei al a coagularii (factorul VIII/factor tisular si factorii X, V, II - protrombina, I - fibrinogenul) si a fost pentru prima data descris in 1935 de Quick. Vezi aici prezentarea schematica succinta a cascadei coagularii si cascadei fibrinolizei. Factorii coagularii II, VII, IX si X sunt sintetizati in ficat sub forma inactiva (structuri proteice ce inc;ud reziduuri unice de acid gamma-glutamil carboxilic) sinteza dependenta de vitamina K. La om sinteza vitaminei K se face de flora intestinala – flora microbiana normala ce colonizeaza intestinul gros. Astfel, valorile normale ale acestor parametrii depind pe de o parte de buna functionare a ficatului cat si de corecta populare a intestinului gros cu flora microbiana (observatie – tratamentul antimicrobian dizloca flora microbiana intestinala producatoare de vitamina K cu modificarea parametrilor la pacientii sub tratament cu warfarina – anticoagulante orale care sunt in esenta inhibitori de vitamina K – anti-vitamine K).

Timpul Quck este un timp de coagulare (masoara viteza de formare a cheagului) prin adaugarea unei cantitati de plasme peste o cantitate definita de tromboplastina tisulara / factor tisular cu adaos de calciu (intial un complex fosfolipidic obtinut din creier de iepure, mai apoi obtinuta prin tehnologie recombinata).

                        Valori normale:

·          Timp Quick      11.5 – 15.0 secunde

·          INR                    0.8 – 1.2 (raport / ratio)

·          AP                     80 – 120%

Timpul de protrombina (timpul Quick) este un folosit in primul rand pentru monitorixarea terapiei cu anticoagulante orale (terapia cu warfarina / antivitamine K / terapia anticoagulanta orala). Deoarece este descrisa o mare variabilitate a timpului de coagulare in functie de tromboplastina folosita, se introduce un parametru nou INR (International Normalised Ratio) = (timp de coagulare pacient / timp de coagulare martor ) ^ ISI (index de international de sensibilitate al tromboplastinei folosite). Intervalul terapeutic pentru monitorizarea terapiei anticoagulante orale (anti-vitamine K) variaza in functie de conditia clinica a pacientului

Intervalul terapeutic INR  - asociat terapei anticoagulante orale este orientativ dupa cum urmeaza:

·          2.0 – 3.0 (medie 2.5) – fibrilatie atriala, pentru profilaxia trombozei venoasa / emboliei pulmonare, boli valvulare, infarct miocardic daca se asociaza aspirina (anti-agregant plachetar), chirugia soldului, sindroamele antifosfolipidice, etc.

·          2.5 – 3.5 (medie 3.0) – valve cardiace mecanice, episoade recurente de tromboza

·          3.0 – 4.0 (medie 3.5) – infarct miocardic, episoade recente de tromboza asociata valvelor mecanice aortice

·          3.5 – 4.5 (medie 4.0) – episoande recente de tromboza asociata valvelor mecanice mitrale.

·          1.5 – 1.9 – prevenirea infactului la pacientii cu risc crescut, episoade de tromboza remise in urma cu 3 – 4 luni.

·          Valori critice INR > 6 – risc major de hemoragie masiva la bolnavul hipertensiv, boala cerebro-vasculara, maladie ulceroasa !

Efectul anticoagulant al medicatiei warfarinice se stabilizeaza la 3 zile de la initierea tratamentului. Astfel, monitorizarea INR trebuie sa inceampa dupa primele 2-3 doze de anticoagulant oral iar PT trebuie masurat saptamanal pana cand rezultatele INR se stabilizeaza in intervalul terapeutic. Cand este necesar un efect anticoagulant rapid, heparina trebuie administrata concomitent cu anticoagulantul oral pana cand la doua determinari succesive INR a fost in intervalul terapeutic. Frecventa determinarilor ulterioare este stabilita de catre medic in functie de raspunsul la tratament – uzual lunar cu maxima atentie la introducerea / intreruperea medicatiei asociate. In practica curenta este frecventa modificarea valorii INR in cazul infectiilor intercurente urmate eventual de administrarea de antibiotice (dizloca flora intestinala producatoare de vitamina K).

·          Valori crescute (alungiri) alte timpului Quick se intalnesc in numeroase boli (boli de sange, boli de ficat), in lipsa vitaminei K, dupa un tratament cu medicamente anticoagulante orale (warfarina, antivitaminice K). Aceasta analiza este ceruta 1/ pentru evaluarea preoperatorie e riscului hemoragipar (inaintea interventiilor chirurgicale, pentru a se stabili daca nu exista riscul unei hemoragii); 2/ pentru explorarea functiei hepatice la persoanele care prezinta sangerari repetate din cavitatea nazala (epistaxis), gingii (gingivoragii), 3/ la bolnavii sub tratament cu medicamente anticoagulante  orale (antivitamine K warfarinice) pentru a urmari efectul acestora.

Pentru personalul medical – conditii de recoltare determinare PT (Quick) / INR / AP)

·          Recoltare – vacutainer albastru (citrat) – cu respectarea raportului : 1 parte anticoagulant – 9 parti sange venos. Recoltarea se face prin punctie venoasa si deoarece presiunea venoasa in momentul recoltarii trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si diastolice, eprubeta cu citrat este ultima care se recolteaza dupa desfacearea garoului. Dupa recoltare se omogenizeaza continutului vacutainerului prin inversiuni repetate ale tubului de recolta. Daca punctia venoasa esueaza, o  noua tentativa pe aceeasi vena se face de abia dupa 10 minute.

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate a probei recoltate. Probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba. Pentru diagnostic tintit este recomandabil specificarea conditiei clinice a pacientului.

·          Tehnica de lucru: determinare directa coagulometrica a PT care masoara viteza de formare a cheagului a unei cantitati predefinite de plasma saraca in plachete peste care se agauga tromboplastina tisulara bogata in ioni de calciu – determinare directa (coagulometrica).

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 1 zile

 TIMP DE TROMBOPALSTINA PARTIAL ACTIVATA (aPTT) - analiza screening utila in evaluarea functiei de coagulare a sangelui: testul exploreaza calea intrinseca (factorii XII, XI, IX, VIII ai coagularii) si calea comuna / complexul protrombinazei al coagularii (factorii X, V, II – protrombina) si factorul I (fibrinogenul). Vezi aici prezentarea schematica succinta a cascadei coagularii si cascadei fibrinolizei.

aPTT este un timp de coagulare (masoara viteza de formare a cheagului) prin adaugarea unei cantitati de calciu (clorura de calciu) peste plasma preincubata cu vezicule fosfolipidice cu adaos de cefalina/kaolin.

Valori normale: 

·          aPTT: 26 – 32 secunde

·          aPTT ratio: 0.9 – 1.2  (raport valori plasma pacient / plasma martor)

Testul are valoare de screening si se foloseste in: 1/ monitorizarea tratamentului cu heparina nefractionata (de obicei la bolnavii spitalizati); 2/ pentru evaluarea preoperatorie a riscului hemoragic; 3/ suspectarea prezentei de inhibitori ai coagularii (ex. anticoagulant lupic). Valoare critica ce asociaza risc de hemoragie: aPTT > 70 secunde, raport aPTT > 2.5.  NOTA – testul nu evaleaza eficienta terapiei heparinelor cu greutate moleculara mica (care inactiveaza doar factuorul Xa) si care inregistreaza valori normale ale aPTT. Valorile aPTT pot fi corelate cu valorile PT:

·          aPTT alungit, PT alungit – initierea terapiei warfarinice (orale) sub protectie de heparina in cursul primelor 3 zile de spitalizare, deficit de factor I (hipofibrigenemii), deficit – consum de factori ai coagularii (coagularea intravasculara diseminata – stadiile terminale, depasite),

·          aPTT alungit, PT normal – deficit de factori ai cascadei coagularii calea intrinseca F XII, F XI, F IX, F VII sau defect al kalicreinei (activator al F XII)

·          aPTT normal cu PT alungit deficitul factorilor coagularii pe calea extrinseca tisulara (F VII, F X, F V) sau terapie cu anticoagulante orale.

·          aPTT scurtat – in neoplazii cu risc de tromboflebite migratorii sau forme metastatice prin hiperproductie de factor VIII, imedita dupa episoadele fulminante de hemoragii masive, in stadiile initiale ale coagularii intravasculare diseminate.

Intervalul terapeutic in cursul heparinoterapiei este in medie dublu fata de valoarea normalului, indicator refectat de raportul intre aPTT pacient / aPTT control. La subiectul normal fara risc de hemoragipar acest raport este aproximativ egal cu 1 (raport unitar). La gravidele cu avorturi repetate (posibil prezenta anticoagulantului lupic) sau la persoanele cu tromboze venoase repetate (trombofilie) se remarca o alungire moderata a acestui parametru pana la 1.5 fata de normal (raport aPTT pacient / aPTT control 1.3 – 1.5). In aceasta situatie, se repeat analiza insa cu un amestec 50% plasma de bolnav / 50% plasma de control; daca anomalia persista (aPTT moderat alungit cu raport > 1.3 fata de control) este posibil prezenta unui "inhibitor" (anticorpi antifosfolipidici ca de exemplu anticoagulantul lupic).

Pentru personalul medical – conditii de recoltare determinare aPTT

·          Recoltare – vacutainer albastru (citrat) – cu respectarea raportului : 1 parte anticoagulant – 9 parti sange venos. Recoltarea se face prin punctie venoasa si deoarece presiunea venoasa in momentul recoltarii trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si diastolice, eprubeta cu citrat este ultima care se recolteaza dupa desfacearea garoului. Dupa recoltare se omogenizeaza continutului vacutainerului prin inversiuni repetate ale tubului de recolta. Daca punctia venoasa esueaza, o  noua tentativa pe aceeasi vena se face de abia dupa 10 minute.

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate a probei recoltate. Probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba. Pentru diagnostic tintit este recomandabil specificarea conditiei clinice a pacientului.

·          Tehnica de lucru: determinare directa coagulometrica a aPPT care masoara viteza de formare a cheagului dupa ce plasma saraca in plachete este preincubata cu un activator (cefalina / kaolin) – la adaugarea ionilor de calciu de determina timpul de formare al chagului folosind un analizor coagulometru – determinare directa (coagulometrica).

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 1 zile

COAGULOGRAMA – analiza inclusa frecvent in screeningul preoperator ce presupune efectuarea a doi parametrii

·          PT – timp de protrombina / Quick, AP si INR (vezi aici explicatii medicale si pregatire pacient)

·          aPTT – timp de tromboplastina partial activata (vezi aici explicatii medicale si pregatire pacient)

Timp de sangerare (sange capilar - lobul urechii – metoda Duke) – metoda de explorare a etapei vasculare – capilare a hemostazei folosita destul de rar in screeningul preoperator. Altenativ se recomanda coagulograma (PT – timp de protrombina si aPTT vezi aici detalii coagulograma). Tehnica efectuarii timpului de sangerare prin metoda Duke este prezentata:  dupa dezinfectarea pielii cu alcool se face o incizie verticala la nivelul tegumentului (la nivelul lobului urechii) cu o lanteta de dimensiuni standardizate. Din momentul aparitiei primei picaturi de sange se porneste cronometrul. Din 30 in 30 minute se culeg picaturile de sange cu ajutorul unei hartii de filtru sau cu un tampon steril. Se opreste cronometrul cand hartia de filtru respectiv tamponul steril nu se mai pateaza de sange. Deoarece incizia trebuie sa intereseze numai dermul, sunt frecvente rezultatele fals crescute sau fals scazute (variatii individuale ale grosimii pielii, folosirea acelor de punctie capilara cu dimensiuni reduse fata de lanseta standardizata).

Valori normale: 

·          TS : 2 – 4 minute (120 – 360 secunde)

Alungiri ale timului de sangerare se intalnesc in: afectiuni trombocitare; trombocitopenii autoimune, aplazii medulare, dizlocarea precursorilor medulari ai trombicitelor de alte linii (leucemii) sau in metastaze medulare ale cancerelor solide (de ex cancerul de prostata, san), deficiente ale factorilor plasmatici ai coagularii: boala Willebrand, (factorul VIII), consum exagerat de fibrinogen (factor I), deficienta de factor IX, X, XI. precum si in angiopatii izolate.

·          Un singur TS alungit nu documenteaza prezenta unei afectiuni, caz in care procedura se va repeta si la celalalt lob!

·          In cazul testului de toleranta a aspirinei (administrarea de aspirina in doze terapeutice antiagregante plachetare 50 – 150 – 250 mg/zi timp de peste 5 zile consecutive) TS este alungit spre limita suiperioara!

·          Cu inaintarea in varsta este o diminiuare a TS spre valorile inferioare, diminuare asociata aterosclerozei capilare, mai evidenta in cazul arteriopatiei diabetice sistemice.

·          Nu exista o corelatie directa intre alungirea TS si riscul de hemoragie interna viscerala.

Pentru personalul medical – conditii de determinare TS – timp de sangerare

·          Recoltare / Tehnica de lucru – se dezinfecteaza lobul urechii cu alcool dupa care se sterge excesul de aclool cu un tifon steril. Se face o incizie pana la nivelul dermului folosind o lanteta dedicata punctiei capilare cu dimensiuni standardizate 1.5 mm lungine, 3 mm adancime dupa care se porneste cronometrul. Se sterg picaturile de sange din 30 in 30 secunde folosind un tifon steril si se cronometreaza timpul in care sangerarea se opreste. Tehnica de executie a TS necesita personal instruit  si dotare tehnica disponibile doar la punctele de recolta.

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate – calitatea sangelui capilar obtinut. Pancientul trebuie sa evite consumul de alcool cu circa 7 zile inainte de determinare, iar medicatia antiagreganta plachetara (asprinele) trebuie specificata sau oprita cu circa 3 zile inanite de determinare.

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 1 zile

Timp de coagulare (sange capilar - pulpa degetului – metoda bazarov) – metoda de explorare a etapei intravasculare a hemostazei folosita destul de rar in screeningul preoperator. Altenativ se recomanda coagulograma (PT – timp de protrombina si aPTT vezi aici detalii coagulograma). Pe o lama de sticla se aplica o picatura de sange capilar (obtinut prin punctie capilara la nivelul pulpei degetului) peste care se aplica o picatura de ser fiziologic si se porneste cronometrul. Lama de sticla se amplaseaza intr-o camere umeda (obtinuta prin amplasarea unei hartii de filtru umezite intr-o cutie Petri) si prin inclinari usoare se determina timpul in care are loc coagularea pe lama. Citirea se face la temperatura camerei prin inclinari repetate din 30 in 30 secunde.

Valori normale: 

·          8 – 10 minute

Timpul de coagulare este un test ce exploreaza functia globala a tuturor factorilor coagularii – test global al coagularii. Alungiri ale timpului de coagulare se intalnesc in deficiente congenitale ale oricarui dintre factori coagularii, in cazul consumului excesiv ai factorilor coagularii (CID coagularea intravasculara diseminata) [recum si terapia anticoagulanta orala warfarinica – antivitaminele K, sau terapia anticoagulanta cu heparina).

Pentru personalul medical – conditii de determinare TC – timp de coagulare

·          Recoltare / Tehnica de lucru – se dezinfecteaza pulpa degetului cu alcool dupa care se sterge excesul de aclool cu un tifon steril. Se face o incizie cu un ac de punctie la nivelul pulpei degetului. Prima picatura se sterge cu ajutorul tifonului steril, iar adoua picatura se lasa sa cada liber peste o lama de sticla care are aplicata o picatura (40 – 50 microl) de ser fiziologic steril. Se porneste cronometrul dupa amplasarea lamei intr-o camera umeda (obtinuta dintr-o placa Petri tapetata cu o hartie de filtru umezita). Prin miscari manuale de rotire, se cronometreaza timpul de formare a cheagului pe lama de sticla. Citirea se face la temperatura camerei prin inclinari repetate ale camerei umede in 30 in 30 secunde. Tehnica de executie a TC necesita personal instruit  si dotare tehnica disponibile doar la punctele de recolta.

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate – calitatea sangelui capilar obtinut. Esantioanele lipemice/hemolizate pot induce modificari ale unor parametrii. Pancientul trebuie sa evite consumul de alcool cu circa 7 zile inainte de determinare, iar medicatia antiagreganta plachetara (asprinele) trebuie specificata sau oprita cu circa 3 zile inanite de determinare.

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 1 zile

Timp de fragilitate capilara (testul garoului) – metoda de explorare a etapei vasculare a coagularii folosita in diagnosticul diferential al petesiilor cutanate de cauza vasculara (vasculopatii) versus cauza plachetara (trombocitopenii). Principul metodei se bazeaza pe crearea unei staze venoase ce favorizeaza extravazarea eritrocitelor prin endoteliul capilar in tesutul subcutanat. Se aplica un garou (manseta de la sistemele de masurare ale tensiunii / presiunii arteriale) care se mentine timp de 5-10 minte la o valoare mai mica decat presiunea sistolica / maxima dar mai mare decat presiunea diastolica / minima. In acest fel, pulsul arterial apare iar intoarcerea venoasa este impiedicata. Se noteaza aparitia petesiilor pe plica antebrahiala.

Valori normale: 

·          la indivizii normali nu apar petesii

Aparitia de rare petesii 3 – 5 se noteaza ca fiind slab pozitiv (+/-), Cu cat numarul de petesii este mai crescut cu atat pozitivitaea este mai accentuala. La copil aparitia catorva petesii nu are nici o semnificatie. Nu se socotesc petesiile aparute la locul compresiunii.

O fragilitate vasculara crescuta se intalneste in; 1/ vasculopatii, tulburari vasculare ale diabeticilor, hipertensivi, nefropatii, hepatopatii precum si in scorbut (deficit de vitamina C) precum si in 2/ deficiente ale factorilor coagularii, subiectii aflati sub terapie anticoagulanta orala 9antivitaminele K) sau deficiente calitative ale fibrinogenului (factorul I al coagularii).

Pentru personalul medical – conditii de determinare testul garoului

·          Tehnica de lucru – se aplica manseta unui aparat de determinare a presiunii arteriale la nivelul antebratului si se masoara tensiunea arteriala (sitolica si diastolica). Se porneste cronometrul dupa ce se stabilizeaza presiunea in garoul de staza astfel incat aceasta sa fie mai mare decat presiunea diastolica dar mai mica decat presiunea sistolica. Dupa 10 minute se desface garoul si se apreciaza pozitivarea testului (aparitia petesiilor). Tehnica de executie necesita personal instruit  si dotare tehnica disponibile doar la punctele de recolta.

·          Pregatire pacient: se recomanda determinarea à jeun (pe nemancate) sau in conditii de repaos fizic in ultimele 4 ore. Pancientul trebuie sa evite consumul de alcool cu circa 7 zile inainte de determinare, iar medicatia antiagreganta plachetara (asprinele) trebuie specificate sau oprita cu circa 3 zile inanitea determinarii.

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 1 zile

TIMP DE TROMBINA – Adaosul de trombina (factorul II al coagularii - enzima cheie a cascadei coagularii) peste plasma deplachetata permite evaluarea fibrinoformarii (transformarea fibrinogenului solubil in fibrina insolubila). Vezi aci prezentarea schematica succinta a cascadei coagularii si cascadei fibrinolizei. Testul este influentat de valoarea fibrinogenului plasmatic, fiind foarte sensibil la prezenta anticoagulantilor circulanti (heparinici si non-heparinici) si agentilor fibrinolitici. Algoritmul diagnostic pentru TT (timp de trombina) alungit:

TT alungit: => amestec parti egale plasma deplachetata pacient: plasma martor normala

·          TT se normalizeaza => scaderea / cresterea fibrinogenului plasmatic (< 150mg/dL respectiv > 900 mg/dL)

·          TT alungit = > prezenta unui anticoagulant circulant de tip heparina, anticoagulant non-heparina sau prezenta PDF rezultati din distructia excesiva a fibrinei – terapie fibrinolitica (streptokinaza-like).

·          TIMPul DE REPTILAZA (Re T) este un timp de coagulare asemanator TT care in loc de trombina foloseste veninul de  Bothrops atrox (o enzima proteolitica asemanatoare trombinei) care prin actiune asupra fibrinogenului elibereaza doar fibrinopeptidul A (spre deosebire de trombina care elibereaza fibrinoprptidele A si B). Reptilaza nu este influentata de heparine, hirudina, Din cauza insemsibilitatii la heparina, ReT este folosit pentru in diagnosticul diferential.

Fibrinogen TT (timp de trombina)   ReT (timp de reptilaza)

normal        scazut                           normal              => prezenta de anticoagulanti circulanti

                                                                                              (heparina, antitrombina, hirudina, etc)

scazut         crescut                         crescut              => cantitate redusa de fibrinogen (productie

deficitara: hepatopatii), consum crescut de

fibrinogen (coagulopatii de consum)        

normal        crescut                         crescut              => prezenta de fibrinogen anormal

(disfibrinogenemii)

Valori normale ale TT – timpului de protrombina: 

·          15 - 25 secunde

·          TT este foarte sensibil la dozele terapeutice de heparinoterapie – excelenta sensibilitate la concentratii plasmatice mici ale heparinei nefractionate (intre 0.05 pana la 0.10 IU/mlL heparina nefractionata - UFH), precum si pentru dozele mari de heparine cu greutate moleculara mica (peste > 0.20 IU/ml heparine fractionate - LMWH) fiind un test ce poate fi folosit in monitorizarea heparinoterapiei nefractionate in conditiile unei fibrinogenemii stabile.

·          TT este sensibil influentat de valoarea fibrinogenului plasmatic fiind util in monitorizarea coagulopatiilor de consum (CID) precum si in disfibrinogenemii sau afibrinogenemii sau hepatopatii.

·          TT este influentat de prezenta PDF (produsilor de degradare ai fibrinei) fiind util in monitorizarea terapiei fibrinolitice cu streptokinaza si urokinaza in conditiile unei concentratii constante a fibrinogenului.

·          Deoarece acest test trebuie intrerpretat si corelat cu alte teste de coagulare, valoarea diagnostica este limitata din cauza variatiilor elilibrului concentratiei fibrinogenului plasmatic. Astfel pentru monitorizarea heparino-terapiei se recurge la aPTT, pentru monitorizarea fibrinolizei se determina D-dimerii, iar concentratia fibrinogenului plasmatic se determina direct prin metode coagulometrice.

Pentru personalul medical – conditii de recoltare determinare timp de trombina

·          Recoltare – vacutainer albastru (citrat) – cu respectarea raportului : 1 parte anticoagulant – 9 parti sange venos. Recoltarea se face prin punctie venoasa si deoarece presiunea venoasa in momentul recoltarii trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si diastolice, eprubeta cu citrat este ultima care se recolteaza dupa desfacearea garoului. Dupa recoltare se omogenizeaza continutului vacutainerului prin inversiuni repetate ale tubului de recolta. Daca punctia venoasa esueaza, o  noua tentativa pe aceeasi vena se face de abia dupa 10 minute.

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate a probei recoltate. Probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba. Pentru diagnostic tintit este recomandabil specificarea conditiei clinice a pacientului.

·          Tehnica de lucru: determinare directa coagulometrica a TT care masoara viteza de formare a cheagului dupa ce plasma saraca in plachete este preincubata trombina.  Se determina timpul de formare al chagului folosind un analizor coagulometru – determinare directa (coagulometrica).

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 1 zile

Rezistenta la proteina C activata – mutatia factorului V / Leiden – Diverse mutatii ale proteinelor cascadei coagularii pot genera rezistenta zimogenilor fata de anticoagulantii naturali (proteinele C / S ale coagularii, antitrombina). Rezistenta fata de anticoagulantii naturali asociaza riscul de tromboze in sistemul capilar, placentar, venos si arterial. Vezi aici prezentarea schematica a mecanismelor si cauzelor trombofiliilor. Mutatia punctiforma G1691A de la nivelul genei care codifica factorul V al coagularii a fost descrisa in 1994 de un grup de lucru din Leiden, Olanda – mutatia Leiden a facorului V care devine rezistent la actiunea anticoagulanta a proteinei C a coagularii (anticoagulant natural) este citata ca fiind responsabila la peste jumatate din cazurile cu trombofilie ereditara. Proteina C a coagularii este un anticoagulant natural important care inactiveaza factorul V al coagularii. Ulterior au fost descrise si alte mutatii ce induc rezistenta factorului V fata de sistemul anticoagulantilor naturali. Mutatia heterozigota a factorului V Leiden determina o crestere de 5 ori a riscului de tromboze pe cand, in cazul celei homozigote, riscul creste de 100 de ori.

Testarea rezistentei factorului V plasmatic se face folosind un amestec de proteina C activata (APC – activated C protein) care va prelungi semnificativ (va dubla) timpul de coagulare la persoanele cu genotip normal (salbatic) in timp ce la pacientii pozitivi pentru mutatie adaugarea APC timpul de coagulare nu va fi influentat semnificativ. Testul folosit este unul coagulometric aPTT-like in care se determina timpul de formare al cheagului pentru plasma deplachetata de pacient versus plasma normala preincubata cu amestec de APC. Se determina raportul plasma pacient/plasma cu rezistenta a factorului V cu un cut-off al raportului de 2.4.

Valori normale

raport timp de coagulare plasma pacient / plasma cu rezistenta la APC > 2.4

Rezistenta la APC – genotip heterozigoti raport < 2 (medie 1.8)

Rezistenta la APC – genotip homozigot raport < 1.5 (medie 1.2)

Obtinerea unui rezultat pozitiv necesita efectuarea testului genetic care depisteaza mutatia factorului V Leiden si stabileste statusul homozigot/heterozigot.

Deficitul important de factor V in plasma (<50%) poate conduce la timpi de coagulare alungiti (valori fals normale). Pentru a preintampina acest fapt se recomanda intreruperea tratamentului anticumadinic (anticoagulantelor orale) cu cel putin o saptamana inaintea efectuarii testului. Testul nu detecteaza rezistenta la proteina C activata de cauza dobandita. Prezenta anticoagulantului lupic nu exercita influenta asupra testului.

Pentru personalul medical – conditii de recoltare determinare rezistenta la proteina C activata APC resistance

·          Recoltare – vacutainer albastru (citrat) – cu respectarea raportului : 1 parte anticoagulant – 9 parti sange venos. Recoltarea se face prin punctie venoasa si deoarece presiunea venoasa in momentul recoltarii trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si diastolice, eprubeta cu citrat este ultima care se recolteaza dupa desfacearea garoului. Dupa recoltare se omogenizeaza continutului vacutainerului prin inversiuni repetate ale tubului de recolta. Daca punctia venoasa esueaza, o  noua tentativa pe aceeasi vena se face de abia dupa 10 minute.

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate a probei recoltate. Probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba. Pentru diagnostic tintit este recomandabil specificarea conditiei clinice a pacientului.

·          Tehnica de lucru: determinare directa coagulometrica automata.

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 3 - 5 zile

ANTICOAGULANT LUPIC – Anticoagulantul lupic (LAC) apartine unui grup special de anticorpi antifosfolipidici indreptati impotiva fosfolipidelor membranare incarcate negativ sau complexelor lipoproteice membranare ce includ fie beta-2-microglobulina 1 sau factori de coagulare cum ar fi de exemplu protrombina (prozimogenul – factorului II al coagularii). Activitatea procoagulanta este diferita in vivo fata de ex-vivo. Astfel, in vivo acesti anticorpi au activitate procoagulanta prin activarea factorilor complexului protrombinazei procese ce se desfasoara pe membranele celulare la nivelul plachetelor sau celulelor endoteliale. Ex-vivo, prezenta anticorpilor antifosfolipidici produce prelungirea timpilor de coagulare pentru teste de tip aPTT la care se foloseste plasma deplachetata.

·          Reactivul folosit pentru LAC Screen (lupus anticoagulant screen) are contine extract de venin (vipera Russel) fiind sarac in fosfolipide fapt ce produce alungirea unui timp de coagulare (TT like > 15 – 25 secunde). Se foloseste raportul

Raport TT like (LAC screen) = TT (LAC screen) pacient / TT (LAC screen) pacienti normali

Daca acest raport este > 1.2 este suspicionata prezenta anticoagulantului lupic care trebuie confirmata.

·          Reactivul pentru LAC confirm (lupus anticoagulant confirm) contine in plus fata de extractul de venin si o componenta fosfolipidica fapt ce sproduce scurtarea timplui de coagulare (TT like < 15 secunde). Se foloseste:

Raport TTlike (LAC confirm) = TT (LAC confirm) pacient / TT (LAC confirm) pacienti normali

·          Diagnosticul prezenteti anticoagulantului lupic este pus de un raport normalizat (RN) intre

Raport normalizat LAC = raport TT like (LAC screen) / raport TT like (LAC confirm)

Normal acest raport trebuie sa fie mai mic de < 1.2

o         Prezenta anticoagulantului lupic este documentata daca  acest raport > 1.2. Valori intre 1.2 – 1.5 ale raportului documenteaza slaba prezenta a anticoagulantului lupic, valori de 1.5 – 2.0 documenteaza prezenta in cantitati moderate a anticoagulantului lupic, iar o valoare a raportului > 2.0 documenteaza prezenta in cantitati crescute a anticoagulantului lupic.

Pentru personalul medical – conditii de recoltare determinare anticoagulant lupic LAC

·          Recoltare – vacutainer albastru (citrat) – cu respectarea raportului : 1 parte anticoagulant – 9 parti sange venos. Recoltarea se face prin punctie venoasa si deoarece presiunea venoasa in momentul recoltarii trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si diastolice, eprubeta cu citrat este ultima care se recolteaza dupa desfacearea garoului. Dupa recoltare se omogenizeaza continutului vacutainerului prin inversiuni repetate ale tubului de recolta. Daca punctia venoasa esueaza, o  noua tentativa pe aceeasi vena se face de abia dupa 10 minute.

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate a probei recoltate. Probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba. Pentru diagnostic tintit este recomandabil specificarea conditiei clinice a pacientului.

·          Tehnica de lucru: determinare directa coagulometrie automata.

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 3 - 5 zile

proteina C a coagularii – activitate – Proteina C a coagularii este un zimogen plasmatic - un anticoagulant natural - a carui sinteza este depenedenta de vitamina K: lantul peptidic include structuri proteice cu reziduuri unice de acid gamma-glutamil carboxilic. Vezi aici prezentarea schematica a mecanismelor trombofiliilor si sistemul anticoagulantilor naturali. Proteina C a coagularii este activata de trombina (factorul II activat) in prezenta trombomodulinei. In vitro proteina C poate fi activata de o fractie proteica derivata din veninul sarpelui Agkistrodon contortrix.

Determinarea rezistetntei la proteina C avtivata este un test cromogenic automat bazat pe reactia de culoare a unui substrat sintetic cromogen: include o etapa in care plasma pacientului este incubata cu un activator al proteinei C (fractie proteica extrasa din venin) urmata de cuantificarea proteinei C activata folosind un substrat cromogen sintetic care elibereaza treptat paranitroalanina, eliberare direct proportionala cu nivelul de protrina C din proba de testat cu determinare cinetica la 405 nm.

Valori normale: activitate proteina C activata 70 – 140%

Deficitul congenital (ereditar, cu transmitere autozomal dominanta) de proteina C a coagularii este asociata cu episoade de tromboza venoasa recurenta la tineri precum si pierderi recurente de sarcina (avorturi recurente in primul trimestru de sarcina). La pacientii cu deficit homozigot de proteina C se poate semnala coagulare intrasculara neonatala fulminanta ce impune diagnostic si tratament prompt. Exista si un deficit dobandit de proteina C a coagularii in afectiunile hepatice cronice, terapia anticoagulanta orala (terapia warfarinica – cumadinica), coagularea intravasculara diseminata din sepsisul sever, etc. Debutul terapiei anticoagulante orale fara pretratament cu heparina la subiectii cu deficit congenital de proteina C a coagualrii poate precipita un episod trombotic.

Pentru personalul medical – conditii de recoltare determinare activitate proteina C

·          Recoltare – vacutainer albastru (citrat) – cu respectarea raportului : 1 parte anticoagulant – 9 parti sange venos. Recoltarea se face prin punctie venoasa si deoarece presiunea venoasa in momentul recoltarii trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si diastolice, eprubeta cu citrat este ultima care se recolteaza dupa desfacearea garoului. Dupa recoltare se omogenizeaza continutului vacutainerului prin inversiuni repetate ale tubului de recolta. Daca punctia venoasa esueaza, o  noua tentativa pe aceeasi vena se face de abia dupa 10 minute.

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate a probei recoltate. Probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba. Pentru diagnostic tintit este recomandabil specificarea conditiei clinice a pacientului.

·          Tehnica de lucru: determinare cromogena – testare automata.

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 3 - 5 zile

proteina S a coagularii – activitate – Proteina S a coagularii este un alt zimogen a carui sinteza este depenedenta de vitamina K: lantul peptidic include structuri proteice cu reziduuri unice de acid gamma-glutamil carboxilic. Proteina S a coagularii este cofactorul proteinei C a coagularii – sistemul anticoagulantilor naturali. Vezi aici prezentarea schematica a mecanismelor trombofiliilor si sistemul anticoagulantilor naturali. Exista doua forme circulante de proteina S: forma libera (aproximativ 40% din cantitatea totala) iar restul circula legata de proteina transportoare a complementului fractia C4b (C4b-binding protein - C4BP). Doar forma libera a proteinei S are activitate functionala anticoagulanta.

Determinarea activitatii functionale a proteinei S se face folosind un test coagulometric asemanator timpului de protrombina (PT-like). Se determina timpul de formare al cheagului al plasmei pacientului in conditiile adaosului de factor tisular, clorura de calciu si proteina C activata. Se raporteaza valoarea obtinuta fata de cea a unei plasme martor deficitara in proteina S a coagularii. Rezultatele se exprima procentual.

Valori normale: activitate proteina S a coagularii 63 – 135%

Deficienta de proteina S a coagularii poate fi ereditara sau dobandita. Deficienta dobandita se inregistreaza la debutul sarcinii, debutul terapiei cu anticioagulante orale (warfarina / cumadinice / antivitamine K), hepatopatii, prematuri sau nou nascuti. Bolile autoimune şi cele inflamatorii se asociază cu deficit dobândit de proteină S prin acţiunea proteinei ce leagă componenta C4 a complemetului. Deficitul de proteina S asociaza un risc crescut pentru aparitia tromboemboliilor mai ales la subiectii tineri.

Pentru personalul medical – conditii de recoltare determinare activitate proteina S a coagularii

·          Recoltare – vacutainer albastru (citrat) – cu respectarea raportului : 1 parte anticoagulant – 9 parti sange venos. Recoltarea se face prin punctie venoasa si deoarece presiunea venoasa in momentul recoltarii trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si diastolice, eprubeta cu citrat este ultima care se recolteaza dupa desfacearea garoului. Dupa recoltare se omogenizeaza continutului vacutainerului prin inversiuni repetate ale tubului de recolta. Daca punctia venoasa esueaza, o  noua tentativa pe aceeasi vena se face de abia dupa 10 minute.

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate a probei recoltate. Probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba. Pentru diagnostic tintit este recomandabil specificarea conditiei clinice a pacientului.

·          Tehnica de lucru: determinare directa coagulometrica automata.

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 3 - 5 zile

Antitrombina III – Antitrombina III sau cofactorul I al heparinei este principalul inhibitor al cascadei coagularii fiind esential in terapia heparinica eficienta. Are rol inhibitor in special asupra proteazelor sistemului coagularii F IIa (trombina), F Xa si F IXa. Vezi aici prezentarea schematica a mecanismelor trombofiliilor si sistemul anticoagulantilor naturali. Deficitul de antitrombina III este asociat riscului de boala tromboembolica, determinarea parametrului fiind folosita pentru a stabili deficitul de antitrombina in special la pacientii ce urmeaza a fi operati (interventii ortopedice laborioase, interventii sfera genitala, etc), anterior administrarii anticontraceptivelor orale la pacientele cu risc, etc.

Determinarea activitatii antitrombinei se bazeaza pe un test cromogen printr-o metoda specifica care nu este influentata de cofactorul II al heparinei. Intr-o prima faza plasma pacientului este incubata cu reactivul de F X in prezenta excesului de heparina. In faza a doua se cuantitica activitatea reziduala a activitatii F Xa folosind ca substrat cromogen paranitroalanina care se elibereaza treptat si este determinata cinetic la 405 nm – invers proportional cu nivelul antitrombinei din plasma pacientului.

Valori normale – activitate antitrombina III - 83 – 128%

Exista deficite cantitative de AT III (tip 1) precum si deficiente calitative (tipul 2) in care moleculele de antitrombina produse nu au activitate anticoagulanta corespunzatoare nivelului antigenic. Valori scazute ale AT III se inregistreaza in starile trombofilice asociate trombozei venoase profunde, coagularii intravasculare diseminate, tromboembolismului pulmonar, sindromului nefrotic (pierdere de AT III in special la pacientii dializati), hepatopatii,  terapie estrogenica, neoplazii cu risc de metastazare. Valori crescute de antitrombina III pot fi intalnite in: hepatita acuta/ colestaza, icter obstructiv, la nou nascuti si copii.

Pentru personalul medical – conditii de recoltare antitrombina III

·          Recoltare – vacutainer albastru (citrat) – cu respectarea raportului : 1 parte anticoagulant – 9 parti sange venos. Recoltarea se face prin punctie venoasa si deoarece presiunea venoasa in momentul recoltarii trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si diastolice, eprubeta cu citrat este ultima care se recolteaza dupa desfacearea garoului. Dupa recoltare se omogenizeaza continutului vacutainerului prin inversiuni repetate ale tubului de recolta. Daca punctia venoasa esueaza, o  noua tentativa pe aceeasi vena se face de abia dupa 10 minute.

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate a probei recoltate. Probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba. Pentru diagnostic tintit este recomandabil specificarea conditiei clinice a pacientului.

·          Tehnica de lucru: determinare cromogena – testare automata.

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 3 - 5 zile

Determinarea Activitatii si Antigenului Factorului von Willebrand Diagnosticul bolii von Wilebrand, cea mai frecventa diatezxa hemoragica, impune teste de laborator specifice. Vezi aici prezentarea generala a diatezelor hemoragice. Agloritmul diagnostic in fata unui bolnav cu sindrom clinic de diateza hemoragica trebuie sa includa:

                FVW: activitate  FVW: antigen            F VIII: c (activitate coagulanta)

Deficit partial FVW (tip 1)                          scazut                 scazut concorant      scazut concordant

Deficit calitativ FVW (tip 2)                        scazut                 scazut marcat           normal / scazut

Deficit total FVW (tip 3)                             foarte scazut      foarte scazut             foarte scazut

Deficit dobandit FVW                                 scazut                normal/scazut          normal/scazut

Hemofilie A (FVIII)                                       normal/scazut   normal                      foarte scazut

Hemofile non-A                                          normal/scazut   normal                      normal   => testare activitate FIX, FXI

Laboratorul determina activitatea factorului von Willebrand printr-o reactie de aglutinare (imunoturbidimetrie) folosind anticorpi antiFVW adsorbiti pe particulede latex – anticorpii specifici sunt indreptati fata de situsul de legare al receptorului plachetar GPIb. Plasma pacientului produce aglutinarea particulelor de latex direct proportionala cu activitatea FVW (unitatile multimerice mari) si determina o scadere a transmiterii luminii in vasul de reactie. Rezultatele sunt exprimate procentual fata de activitatea plasmei normale.

Valori normale activitate factor von Willebrand:

persoane cu grupa O                   38 - 125 % activitate factor von Willebrand

personae cu grupa A / B / AB     49 – 170% activitate factor von Willebrand

Laboratorul determina nivelul antigenic al factorului von Willebrand plasmatic printr-o reactie de aglutinare este masurata cresterea turbiditatii produsa de aglutinarea amestecului de reactie indus de un reactiv de latex ce are anticorpi policlonali fata de factorul Willebrand – se masoara scadrea transmisiei luminii datorata prezenteti agregatelor. Rezultatele sunt exprimate procentual fata de activitatea unei plasme normale

Valori normale antigen factor von Willebrand

persoane cu grupa O                   41 – 126% nivel antigenic factor von Willebrand

persoane cu grupa A / B / AB     61 – 158% nivel antigenic factor von Willebrand

Pentru diagnosticului tipurilor 2 de boala Willebrand (defecte calitative) se face un raport intre activitatea FVW / nivelul antigenic al FVW care daca este mai mic de 0.7 are semnificatia unor scaderi discordante ale activitatii FVW si orienteaza inspre deficitele calitative ale FWV, diagnosticate in continuare de centrele de referinta.

Pentru personalul medical – conditii de recoltare determinare activitate ssi antigen factor Willebrand

·          Recoltare – vacutainer albastru (citrat) – cu respectarea raportului : 1 parte anticoagulant – 9 parti sange venos. Recoltarea se face prin punctie venoasa si deoarece presiunea venoasa in momentul recoltarii trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si diastolice, eprubeta cu citrat este ultima care se recolteaza dupa desfacearea garoului. Dupa recoltare se omogenizeaza continutului vacutainerului prin inversiuni repetate ale tubului de recolta. Daca punctia venoasa esueaza, o  noua tentativa pe aceeasi vena se face de abia dupa 10 minute.

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate a probei recoltate. Probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba. Pentru diagnostic tintit este recomandabil specificarea conditiei clinice a pacientului.

·          Tehnica de lucru: determinare imunoturbidimetrica – latex aglutinare.

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 5 zile

Determinare activitate coagulanta factor VIIIc (VIII:C) Vezi aici prezentarea generala a hemofiliilor / diatezelor hemoragice. Factorul VIII  este o proteina plasmatica cu greutate moleculara mare sintetizata in ficat care actioneaza ca si cofactor in activarea factorului IX, complexul F IX – F VIII fiind un potent activator al complexului protrombinazei (activeaza factorul X cu o potenta net superioara activarii complexului F VII-factor tisular). Factorul VIII circula in plasma intr-o forma legata de factorul vW (1 molecula de factor VIII – 50 molecule de factor vW). Deficienta de factor VIII produce un sindrom hemoragic clasic descris: hemofilia. Gena pentru FVIII este localizata pe bratul lung al cromozomului X – hemofilia clasica fiind o maladie cu transmitere legata de cromozomul X. Pe de alta parte, nivele crescute ale F VIII sunt inregistrate in trombofilii sau paraneoplazic.

Laboratorul determina activitatea factorului VIII folosind un test aPTT – like modificat in care plasma de pacient este diliuata cu o plasma deficitara in factor VIII; corectia timpului de coagulare este direct proportionala cu activitatea factorului VIII in plasma pacientului, rezulatele fiind raportae la o curba de calibrare. Rezultatele sunt exprimate procentual.

Valori normale activitate F VIII – 50 – 150%

Pentru personalul medical – conditii de recoltare determinare activitate coagulanta F VIII

·          Recoltare – vacutainer albastru (citrat) – cu respectarea raportului : 1 parte anticoagulant – 9 parti sange venos. Recoltarea se face prin punctie venoasa si deoarece presiunea venoasa in momentul recoltarii trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si diastolice, eprubeta cu citrat este ultima care se recolteaza dupa desfacearea garoului. Dupa recoltare se omogenizeaza continutului vacutainerului prin inversiuni repetate ale tubului de recolta. Daca punctia venoasa esueaza, o  noua tentativa pe aceeasi vena se face de abia dupa 10 minute.

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate a probei recoltate. Probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba. Pentru diagnostic tintit este recomandabil specificarea conditiei clinice a pacientului.

·          Tehnica de lucru: determinare directa coagulometrica a aPPT like.

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 5 zile.

TCLE – TIMPUL DE LIZA AL CHEAGULUI EUGLOBULINIC -  este un test global ce exploreaza fibrinoliza – vezi aici prezentarea schematica a sistemului fibrinolitic. Fractiunea euglobulinica a plasmei se refera la proteinele plasmatice care precipita in mediu acid: fibronogen, plasminogen si activatorii plasminogenului tPA (antiplsaminele raman in supernatantul care se indeparteaza prin centrifugare). Plasma deplachetata de pacient este diluata 1/20 cu o solutie de acid acetic 1%. Dupa centrigugare precipitatul se redizolva in solutie tampon si apoi clorura de calciu. La incubare se formeaza un cheag urmat mai apoi de liza cheagului la circa o ora (60 minute – 180 minute).

·          TCLE este sensibil influentat de valoarea fibrinogenului (valori de peste 600 mg/dL ale fibrinogenului alungesc TCLE). Exista si variatii mari legate de varsta, sex si conditie fiziologica (valori mai crescute la femei, gravide, batrani). Exista mari variatii ale TCLE in randul indivizilor sanatiosi motiv pentru care testul trebuie intrerpretat si corelat cu alte teste de coagulare.

·          Utilitatea diagnostica a testului ramane pentru diagnosticul sindroamelor fibrinolitice primare (rare) si fibrinolizei secundare (frecventa, asociata CID, cancerelor urogenitale sistemice – secretie de uPA, by-pass cardiopulmonar cu clamparea aortei, terapie trombolitica din infarctul miocardic, hepatopatii, etc)

·          Valoare critica diagnostica pentru sindroamele fibrinolitice < 60 minute

o         sindrom fibrinolitic supraacut < 15 min,

o         sindrom fibrinolitic acut 15-30 min,

o         sindrom fibrinolitic subacut 30-60 min

o         TCLE nu poate face diferenta intre un sindrom fibrinolitic primar (crestere t-PA, scadere inhibitor t-PA) si unul secundar (CID)

·          Valori crescute ale TCLE > 180 minute sunt asociate starilor de hipofibrinoliza ce pot aparea in sindroamele tromboembolice (tromboza venoasa, embolism pulmonar, tromboza coronariana, atac ischemic tranzitor sau AVC), boala aterotrombotica, tromboza postoperatorie (caracterizate prin niveluri crescute de PAI-1), sarcina (niveluri crescute de PAI-1 si PAI-2 produs de placenta), administrarea de inhibitori ai fibrinolizei (acid epsilon aminocaproic la pacientii cu CID).

Pentru personalul medical – conditii de recoltare determinare TCLE

·          Recoltare – vacutainer albastru (citrat) – cu respectarea raportului : 1 parte anticoagulant – 9 parti sange venos. Recoltarea se face prin punctie venoasa si deoarece presiunea venoasa in momentul recoltarii trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si diastolice, eprubeta cu citrat este ultima care se recolteaza dupa desfacearea garoului. Dupa recoltare se omogenizeaza continutului vacutainerului prin inversiuni repetate ale tubului de recolta. Daca punctia venoasa esueaza, o  noua tentativa pe aceeasi vena se face de abia dupa 10 minute.

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate a probei recoltate. Probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba. Pentru diagnostic tintit este recomandabil specificarea conditiei clinice a pacientului.

·          Tehnica de lucru: determinare manuala conform protocolului de lucru din laborator.

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 5 zile

D-dimerii – D-Dimerii sunt fractiuni antigenice regasite in componenta solubila rezultata din degradarea fibrinei sub actiunea plasminei (enzima cheie a fibrinolizei). Plasmina (o serin proteaza puternica) digera lanturile insolutibile cross-linkate de fibrina rezultand diverse componente solubile cu greutati moleculare variate. Produsele de degradare ale fibrinei contin un neoantigen (domeniul D-dimer) care nu este present in molecula initiala de fibrinogen. Determinarea D- dimerilor a inceput sa devina un test screening pentru diagnosticul tromboemboliilor si pentru a monitoriza terapia trombolitica. Testul are valoare predictiva negativa inalta ( un test negativ exclude prezenta trombilor). Decelartea prezentei D-Dimerilor indica prezenta unui proces trombotic (fara a fi specific teritoriului: tromboza pulmonara, tromboza venoasa, tromboza coronariana, tromboza cerebrala, etc).

Pentru determinarea screening a D-Dimerilor se foloseste un test de latex-aglutinare - particule de latex tapetate cu fractia F(ab)2 a anticorpilor monoclonali fata de neoantigenul D-dimer: in cazul unei reactii pozitive se produce o aglutinare cuantificabila prin turbidimetrie (aglutinare prin imunoturbidimetrie). Concentratiile de D-dimeri sunt exprimate in ng/mL – valori normale 0 – 500 ng/mL (0 – 0.5 microg/mL), efectul de prozona (reactii fals negative) fiind inregistrat la concentratii ale D-dimerilor mai mari de 320000 ng/mL (320 microg/mL). Deoarece nu exista o standardizare a raportarii rezultatlor pentru D-Dimeri 1 ng/mL corespunde unei unitati de D-dimeri (DD-U). Fiindca cantitatea de D-dimeri depinde de nivelul fibrinogenului plasmatic, producatorii exprima cantitatea de D-dimeri in FEU (unitati echivalente de fibrinogen) 2 FEU = 1 DD-U dupa cum urmeaza:

Valori normale D dimeri           

•     0 – 500 ng/mL DD-U (0 – 0.5 microg / mL  DD-U)
•     0 – 250 ng/mL FEU (0 – 0.25 microg / mL FEU)

•     Valorile moderat crescute D-dimeri          3 microg / mL FEU (titru 1:8)
•     Valori inalt crescute D-Dimeri                  > 16 microg / mL FEU (titru 1:64)

Determinarea D-dimerilor este utila în diagnosticarea şi monitorizarea afecţiunilor ce predispun la hipercoagulabilitate şi tromboze. Testul are valoare predictiva negativa pentru tromboza venoasa profunda a membrelor inferioare si tromboembolismul pulmonar in sensul ca obtinerea unui rezultat negativ la pacientii suspectati de aceste afectiuni exclude prezenta maladiei. Investigatia este utila in suspiciunea de tromboză venoasă profundă, infarct miocardic acut, trombembolism pulmonary, coagulare intravasculara diseminata – CID – precum si pentru monitorizarea tratamentului trombolitic (de ex. streptokinaza in cazul infactului miocardic acut). Nivele crescute mai pot fi intalnite in: boli vasculare aterosclerotice, anevrism disecant de aorta, afecţiuni inflamatorii sistemice, sarcină, neoplasme de san sau ovariene, după intervenţii chirurgicale sau traumatisme. Valori crescute ale fibrinogenului plasmatic (peste 1000 mg/dL) pot produce pozitivarea testului.

Pentru personalul medical – conditii de recoltare determinare D-dimeri

·          Recoltare – vacutainer albastru (citrat) – cu respectarea raportului : 1 parte anticoagulant – 9 parti sange venos. Recoltarea se face prin punctie venoasa si deoarece presiunea venoasa in momentul recoltarii trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si diastolice, eprubeta cu citrat este ultima care se recolteaza dupa desfacearea garoului. Dupa recoltare se omogenizeaza continutului vacutainerului prin inversiuni repetate ale tubului de recolta. Daca punctia venoasa esueaza, o  noua tentativa pe aceeasi vena se face de abia dupa 10 minute.

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate a probei recoltate. Probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba. Pentru diagnostic tintit este recomandabil specificarea conditiei clinice a pacientului.

·          Tehnica de lucru: determinare manuala – aglutinare conform protocolului de lucru din laborator.

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 3 zile

Retractia cheagului – este un test ce investigheaza global functia plachetara. Depinde de numarul si functia plachetelor. In scop investigational se folosesc doua tehnici:

-          recoltarea de sange venos in eprubeta fara anticoagulant si fara activatori ai cheagului (dop rosu) cu amplasarea recipentului de recolta in termostat (37 grade Celsius) si aprecierea la 2 ore si respectiv 24 ore a cantitatii de ser expulzat). Valori normale: 30% ser expulzat la 2 ore, 45% ser expulzat la 24 ore.

-          recoltarea de sange capilar (pulpa degetului) cu amplasarea sangelui capilar in picatura pe lama si aprecierea timpului de aparitie a unei picaturi de ser. Testul se efectueaza in duplicat si necesita manulaitate speciala din partea persoanei care recolteaza. Dupa recolta se amplaseaza lama intr-o camera umeda (asemanator cu TC) si se urmareste timpul de aparitie a primei picaturi de ser. Valori normale metoda capilara – 30 minute.

Retractia cheagului este influentata nu numai de numarul si functia plachetelor dar si de numarul de eritrocite (valori crescute in anemiile cu numar redus de hematii, valori crescute in poliglobuliile cu numar mare de hematii – valoarea hematocritului fiind importanta pentru aprecierea in context), precum si de valoarea fibrinogenului (valori crescute in caz de hipo/disfibrinogenemii, valori scazute in hiperfibrinogenemii). False iretractibilitati survin in cazul lipirii cheagului la peretii eprubetei de recolta.

Clasic testul este util in diagnosticul trombasteniilor – valori crescute (trombastenia Glantzman, defect de GP IIa/IIIb), sindrom Bernard-Soulier (deficit GPIb/IX, V),  pseudoboala von Willebrand (defectGP Ib)in care numarul plachetelor este normal.

Pentru personalul medical – conditii de recoltare determinare retractia cheagului

·          Recoltare – vacutainer rosu (fara anticoagulant cu/fara gel activator) – sange venos (punctie venoasa)

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate a probei recoltate –  probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba sau emite un comentariu referitor la conformitatea produsului). Pentru diagnostic tintit este recomandabil specificarea conditiei clinice a pacientului.

·          Tehnica de lucru: recipientul de recolta (sange venos) nu se centrifugheaza si se amplaseaza in termostat 37 grade Celsius dupa care se apreciaza retractia cheagului la 2 ore si respectiv la 24 ore.

·          Rezultate vizibile on-line - da - in 3 zile.

PFA – 100 / studiul agregarii plachetare - Expune plachetele din sange integral la un flux rapid (5000  - 6000/sec) prin tuburi capilare si monitorizarea scaderii fluxului pe masura formarii dopului hemostatic in centrul unei membrane acoperite cu ADP si colagen (cartus Col/ADP) sau colagen si epinefrina (cartus Col/EPI). Evalueaza hemostaza primara cu evaluarea functionala a plachetelor. Inve-stigatia este utila pentru decelarea defectelor plachetare functionale congentitale sau induse de medicamente. Rezultatul testului exprimat ca timp de inchidere al aperturii.

Valori normale : timp de inchidere al aperturii 5 – 8 minute

Investigatia este utila in studiul functiei plachetare la bolnavii cu modificari ale hemostazei primare  - de exemplu bolnavii cu boala von Willebrand. La aceasta categorie de subiecti se poate verifica si eficacitatea terapiei cu desmopresina (DDAVP) inaintea interventiilor chirurgicale. De asemenea testul este util si pentru evaluarea disfunctiei plachetare indusa de asprina, evaluarea functiei plachetare preoperator in sarcina cu risc crescut precum si la femeile cu menoragii. In scop de cercetare poate fi evaluat efectul medicatiei antiagregante.

Pentru personalul medical – conditii de recoltare determinare PFA - 100

·          Recoltare – vacutainer albastru (citrat) – cu respectarea raportului : 1 parte anticoagulant – 9 parti sange venos. Recoltarea se face prin punctie venoasa si deoarece presiunea venoasa in momentul recoltarii trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si diastolice, eprubeta cu citrat este ultima care se recolteaza dupa desfacearea garoului. Dupa recoltare se omogenizeaza continutului vacutainerului prin inversiuni repetate ale tubului de recolta. Daca punctia venoasa esueaza, o  noua tentativa pe aceeasi vena se face de abia dupa 10 minute.

·          Pregatire pacient: se recomanda recoltarea à jeun (pe nemancate) sau postprandial (peste 4 ore de la ultima masa pentru a atinge criteriul de conformitate a probei recoltate. Probele lipemice/hemolizate/insuficient recoltate/coagulate pot induce modificari ale unor parametrii caz in care laboratorul poate respinge proba. Pentru diagnostic tintit este recomandabil specificarea conditiei clinice a pacientului.

·          Tehnica de lucru: determinare folosind analizorul PFA 100 – ce masoara viteza de inchidere a aperturii folosind un cartus cu colagen / ADP sau colagen / epinefrina.

·          Rezultate vizibile on-line – da -  in 1 zile

Trombelastometrie TEM / TROMBELASTROGRAMA – studiul TEM analizeaza proprietatile vascoelastice ale cheagului sanguin obtinut din sange integral. este util in diagnosticul diferential rapid in cazul sangerailor acute din traumatologie, chirurgie cardiaca, transplantul dce organe, interventii obstetricale, interventii chirurgicale generale si in pediatrie (volume de proba de 300 microL/test). Sunt mai multe protocoale de lucru:

-    Protocoalele IN-TEM si EX-TEM caracterizeaza proprietatile cheagului farmat din sangele integral  dupe ce se declanseaza caile intrinseca si respectiv extrinseca ale coagularii. Specific, protocolul IN-TEM - 300 microL de sange citrat este recalcificat cu clorura de calciu; cascada coagularii este declansata prin adaosul de fosfolipide partiale cu tromboplastina si acid elagic. Protocolul EX-TEM foloseste tromboplastina din creierul de iepure.

-    Protocolul NA-TEM (non-activated TEM) evalueaza proprietaile cheagului din sange integral fara a folosi activatori specifici ai coagularii. Protocolul FIB-TEM evalueaza proprietatile cheagului folosind un inhibitor al functiei plachetare Cytochalasin D.

  CASCADA COAGULARII

=> Cale tisulara – extrinseca (F tisular, F VII)

=> Cale intrinseca (F. XII, F.XI, F IX, F.VIII)

=> Complex protrombinaza (F X si F V) ce activeaza F II

·          TROMBINA ( F II - enzima cheie a cascadei coagularii)

=> fibrinogen F I (solubil) => fibrina (insolubila) => (se formeaza cheagul de fibrina)

Anticoagulanti naturali:

·          AT III (antitrombina) inactiveaza trombina (F IIa) F Xa, F IXa, secundar F XII, F XI si complexul F tisular – F VII

·          Proteina C / cofactor Proteina S inactiveaza F V / F VIII

CASCADA FIBRINOLIZEI

Liza chaegului de fibrina cu eliberare de

=> produsi de degradare ai fibrinei (PDF)

=> D-dimeri = > se reia fluxul sanguin in segmentul afectat !

·          PLASMINA (enzima cheie a cascadei fibrinolizei)

Activatori naturali ai plasminei – agenti fibrinolitici naturali

·    tPA – activatorul tisular al plasminogenului

Agenti fibrinolitici terapeutici folositi pentru liza chaegului de fibrina in AVC (accidentul vascular cerebral ischemic), infarctul de miocard, alte tromboze.

·    Steptokinaza, urokinaza, etc

Trombofilia este o conditie medicala (ereditara sau dobandita) ce defineste un risc major pentru evenimete trombotice in teritoriul venos, capilar, placentar sau arterial cu expresie clinica variata dupa cum urmeaza: tromboze pulmonare (tromboembilism pulmonar postoperator), tromboze venoase periferice, tromboze in circulatia capilara (CID in conditii de soc septic), tromboze in circulatia placentara (avorturi repetitive prin tromboze placentare in primele saptamani de sarcina exacerbate de terapia substitutiva hormonala in antecedente), tromboze rare (infarcte in teritoriul cerebral, renal, digestiv, cardiac, etc).

Cauzele trombofiliilor = risc de tromboze teritoriul venos / capilar / placentar / arterial

1/ Deficitul anticoagulantilor naturali

·          Antitrombina III – anti F II (trombina), F X, F IX

·          Proteina C a coagularii (sinteza vitamina K dependenta) – anti F V , F VIII

·          Proteina S a coagularii (sinteza vitamina K dependenta ) – cofactor proteina C coagualrii

Hemofilia – diatezele hemoragipare definesc un risc major pentru evenimete hemoragice. Substratul cauzal al diatezelor hemoragice este deficienţa cantitativa sau calitativa a unor proteine plasmatice. Bolnavul sangereaza un timp mai îndelungat după traumatisme chiar minore. Generic, hemofiliile / diatezele hemoragice grupeaza boli cu tablou clinic asemanator dar cu substrat etiologic diferit si cu modalitate de transmitere diferita. In ordinea frecventei exista:

1 / Anomaliile sau deficitul factorului Von Willebrand cea mai frecventa cauza de diateza hemoragica la 1% in populatia generala manifesta prin evenimente hemoragice de importanta clinica la 1% din subiectii afectati. Factorul von Willebrand este o proteina compusa din unitati dimerice legate prin punti disulfidice care fac complexe multimerice cu greutate mica, intermediara si mare. Unitatile mici au ca functie principala trasportul factorului VIII plasmatic. Unitatile multimerice cu greutate moleculara mare au receptori pentru colagen si pentru receptorii plachetari GPIb, GPIIb/IIIa cu rol in adeziunea plachetara la locul de injurie al endoteliului vascular. Deficitul de FvW are nu numai determinism genetic dar poate aparea si paraneoplazic, secundar in boli autoimune, indus medicamentos, etc.

·               tipul 1 boala von Willebrand – deficienta partiala de fvW, nivel redus concordant al antigenului si activitatii (FVW:Ag si FVW:Activity), nivel redus de FVIII, toti multimerii prezenti.

·                tipul 2 boala von Willebrand – in care anomaliile calitative ale unitatilor multimerice mari produc scaderea marcata a activitatii) discordant fata de nivelul antigenului FVW si nivelul activitatii coagulante a F VIII. Poate asocia episoade de trombocitopeie. Deficientele calitative pot fi dobandite, secundar.

·                tipul 3 boala von Willebrand – deficienta totala de fvW – cu sindrom hemoragipar grav, rar.

2 / Deficitul factorilor de coagulare – factor VIII (factor antihemofilic), factor IX, factor XI

·          Hemofilia A – deficit de factor VIII – boala X-linkata – hemofilia clasica mai frecventa

·          Hemofilia B – defcit de factor IX – boala Christmas – boala X linkata.

·          Hemofilia C – deficit de factor XI – maladie ce afecteaza ambele sexe in mod egal.